中性粒细胞——汉坦病毒所致内皮屏障破坏的头号杀手！
2015年，德国柏林夏里特医学院医学病毒学研究所的Gunther Schönrich教授团队在《Frontiers in Microbiology》（Q1，IF=4.5）上发表了一篇题为“Hantavirus-induced disruption of the endothelial barrier: neutrophils are on the payroll”的综述文章。其重点结论如下：
① 汉坦病毒感染诱导的血管通透性增高并非由病毒直接细胞病变效应引起，而是免疫机制发挥核心作用，其中中性粒细胞是一个长期被忽视的关键致病因素。
② 在活化的内皮细胞附近，被β2整合素信号激活的中性粒细胞可发生NETosis，通过释放NETs直接损伤内皮屏障，导致渗漏。
③ 即使不发生NETosis，被募集的中性粒细胞也可通过释放TNF-α、VEGF等细胞因子，间接诱导VE-钙粘蛋白降解，增加血管通透性。
④ 在严重联合免疫缺陷小鼠模型中，耗竭中性粒细胞可预防肺炎和血管通透性增高，而糖皮质激素治疗因不抑制NETosis在临床上未显示获益，进一步证实了中性粒细胞在汉坦病毒免疫发病机制中的核心地位。
该综述首次明确强调了中性粒细胞在汉坦病毒致病机制中的重要角色，为汉坦病毒出血热的治疗干预提供了以中性粒细胞为靶点的新思路。
病毒性出血热（VHF）由分属不同病毒科的病毒引起，其中一科为布尼亚病毒科。在结构上，汉坦病毒具有源自宿主细胞膜的包膜。其基因组由三个负链RNA节段组成，分别编码核蛋白（N）、两种糖蛋白（Gn和Gc）以及一种RNA依赖性RNA聚合酶。根据其自然储存宿主的地理位置及其诱发的疾病综合征，汉坦病毒被分为旧世界和新世界汉坦病毒种。
人类吸入源自持续感染但无症状的自然储存宿主（通常为啮齿动物）排泄物的气溶胶后感染汉坦病毒。根据所涉及的汉坦病毒种类，其诱导疾病的严重程度各异，病死率从低于1%到高达40%以上不等。旧世界汉坦病毒种，如汉滩病毒（HTNV），与肾综合征出血热（HFRS）相关。经过约3周的潜伏期后，HFRS以发热期及进一步的非特异性症状起病。随后出现低血压和少尿，最终可能导致致命的休克。患者在病程第二周开始进入多尿期后恢复。一种轻症HFRS，亦称流行性肾病，在欧洲呈地方性流行，病死率低于1%，主要由普马拉病毒（PUUV）感染引起。相比之下，感染新世界汉坦病毒种，如辛诺柏病毒（SNV），可导致汉坦病毒心肺综合征（HCPS）。在HCPS病程中，患者出现肺水肿和心力衰竭，而HFRS则以肾功能衰竭为突出临床特征。安第斯病毒（ANDV）是最致命的新世界汉坦病毒种，病死率高达40%以上。它是唯一有报道可发生人际传播的汉坦病毒种。某些汉坦病毒种，如希望山病毒（PHV）为非致病性，而另一些，如图拉病毒（TULV）仅零星致病。中国每年报告2万至5万例HFRS病例，占全球HFRS病例的90%。
非免疫学机制
汉坦病毒在内皮细胞（EC）培养物中感染和复制，不引起任何细胞病变效应或通透性增加。然而，在血管内皮生长因子（VEGF）存在下，HTNV或ANDV在人脐静脉内皮细胞中的复制会下调粘附连接的主要成分——血管内皮（VE）-钙粘蛋白，从而破坏内皮屏障。最近，在无外源性VEGF的情况下，ANDV感染原代人肺微血管内皮细胞后，也观察到VE-钙粘蛋白降解。这一发现在另一个使用体外毛细血管的实验体系中未得到证实。在该体系中，发现感染HTNV或ANDV可导致激肽释放酶-激肽系统激活，并释放血管通透性强效诱导剂缓激肽。与此一致的是，一例PUUV感染患者使用缓激肽受体拮抗剂后，临床结局有所改善。最后，感染PUUV的肾小球内皮细胞表现出细胞间连接的破坏.
汉坦病毒免疫发病机制
固有免疫和适应性免疫应答，以及体液和细胞免疫机制，均参与了汉坦病毒相关疾病。人树突状细胞（DC）具有高度移动性，并连接固有免疫和适应性免疫。DC驻留于外周组织（包括呼吸道粘膜和肺泡）的病原体-宿主界面。它们可将其树突状突起推入气道腔，从而通过上皮紧密连接进行”浮潜”。因此，DC可能在吸入病毒颗粒后不久即在肺部被汉坦病毒感染。与此相符，人DC在体外对HTNV和ANDV感染敏感。此外，感染HTNV的单核细胞可发育为DC样细胞。DC可能充当”特洛伊木马”，帮助病原体在人体内播散，并最终感染各器官中的内皮细胞。或者，DC可能在后期与已感染的人内皮细胞屏障接触时才被感染。与大多数其他嗜DC病毒形成鲜明对比的是，旧世界和新世界汉坦病毒种均在体外诱导DC成熟。这意味着在人体内，汉坦病毒感染的DC会迁移至引流淋巴结，并诱导强烈的适应性免疫应答。
相应地，对致死性人HCPS病例的组织病理学分析显示，尤其在肺组织中存在大量单个核细胞浸润。同样，HFRS患者的支气管道粘膜活检和支气管肺泡灌洗液显示，感染部位存在活化的CD8+ T细胞，且血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）表达显著上调。基于非人灵长类和叙利亚仓鼠的HCPS动物模型证实，过度且异常的组织特异性宿主反应与血管通透性增高相关。然而，不明原因的是，在叙利亚仓鼠中，T细胞耗竭既不改变病毒载量，也不影响HCPS的临床病程。令人好奇的是，大多数与汉坦病毒疾病严重程度相关的宿主基因，均与异常免疫应答甚至自身免疫性疾病有关。与此观点一致的是，在汉坦病毒感染患者中检测到抗核抗原的自身抗体水平升高，
内皮细胞的活化
对HFRS患者肾活检的免疫组织学研究揭示，在PUUV感染期间，内皮细胞被激活，并增加趋化因子和粘附分子的表达，如ICAM-1、E-选择素和VCAM-1。后者对于调节内皮细胞与免疫细胞的相互作用至关重要。汉坦病毒是否直接上调内皮细胞上的粘附分子尚存疑问。然而，已确定的是，汉坦病毒感染期间受刺激的免疫细胞会释放TNF-α，后者是内皮细胞粘附分子的强效诱导剂。
汉坦病毒感染期间上调的趋化因子包括IL-8，这是一种关键的中性粒细胞募集趋化因子和活化剂。令人好奇的是，在一些研究中，IL-8水平与严重急性病呈正相关，提示它是重要致病环节的一部分。此外，内皮细胞上HLA（人白细胞抗原）I类分子的表达增加。这些分子包括HLA-E，后者作为活化性NK细胞受体NKG2C的配体。因此，汉坦病毒感染的内皮细胞可与多种免疫效应细胞相互作用，如HLA I类限制性CD8+ T细胞、受HLA-E刺激的NK细胞以及中性粒细胞。
细胞毒性免疫细胞
活化免疫细胞的细胞毒活性可能清除汉坦病毒感染的内皮细胞，从而引起血管渗漏。一种SNV特异性CD8+ T细胞系裂解了HLA相合的SNV感染的内皮细胞，从而增加了血管通透性。此外，T细胞参与的观点也得到遗传易感性研究的支持。与此相符，研究人员近期在HFRS患者中检测到增强的内皮修复活动。穿孔素和颗粒酶B以及游离DNA血清水平的升高，进一步支持了细胞毒性免疫机制的作用。然而，对致死性HCPS病例组织的组织病理学检查，未发现可解释HCPS患者血管渗漏现象的坏死或任何明显可见的病变。这可能是由于难以观察到内皮损伤微小但功能相关的形态学表现。此外，凋亡的内皮细胞可能立即被巨噬细胞或中性粒细胞吞噬。
有证据表明，汉坦病毒感染的内皮细胞至少在一定程度上受到保护，免受细胞毒性T细胞和NK细胞的攻击。然而，未感染的内皮细胞对细胞毒性攻击易感，并可能易遭受旁观者杀伤。例如，一个NK细胞亚群通过汉坦病毒感染内皮细胞上增加的HLA-E表达而被激活，随后可能攻击未感染的内皮细胞。这种NK细胞的旁观者攻击，可能因未感染细胞比汉坦病毒感染的内皮细胞表面表达更少的抑制性HLA I类分子而更为便利。
中性粒细胞
Methnkioff（1887）首先提出，多形核细胞释放的物质可损害内皮细胞功能。然而，中性粒细胞在汉坦病毒诱导疾病的模型中一直被忽视，尽管它们是数量最丰富的免疫细胞类型。事实上，在HCPS患者中曾报道有富含中性粒细胞的浸润。此外，在汉坦病毒相关疾病期间，血液中观察到杆状核形态的中性粒细胞数量增多。这种中性粒细胞亚型极可能代表一种典型的核左移反应，该反应通常在细菌攻击后发现，并可调节T细胞应答。近期研究表明，中性粒细胞总体上可促进汉坦病毒诱导的免疫发病机制。与活化的内皮细胞相互作用后，中性粒细胞会经历NETosis，这是一种新近发现的中性粒细胞程序性细胞死亡形式。其特征是产生和释放NETs。NETs是由双链DNA骨架构成、表面包裹组蛋白及颗粒分子（如MPO、NE和CG）的纤维网络。邻近内皮细胞的NETosis具有破坏性，并导致血管通透性增加。
中性粒细胞表达β2整合素，即β2αL、β2αM和β2αX。近期一项研究表明，汉坦病毒通过β2整合素信号强烈激活中性粒细胞，导致NETosis。此外，在VHF期间，活化的血小板将中性粒细胞迅速募集到发炎的内皮细胞部位。随后，血小板蛋白与中性粒细胞上β2整合素的相互作用介导了血小板-白细胞聚集。多个感染模型已证实，通过β2整合素介导的血小板-中性粒细胞相互作用也可导致NETosis。因此，β2整合素可能在VHF期间充当NETosis的主开关（图1A）。
图1 | 汉坦病毒感染期间，中性粒细胞介导的促进血管渗漏的拟议机制。 中性粒细胞通过病毒诱导的β2整合素信号被激活。活化的血小板也通过β2整合素刺激中性粒细胞。根据所涉及的β2整合素配体以及微环境信号的不同，中性粒细胞可能（A）释放NETs，或（B）产生炎性细胞因子，如TNF-α和VEGF，而非发生NETosis。活化的血小板可诱导NETosis并释放增加血管通透性的介质。最终，这两种途径均导致内皮屏障破坏。EC，内皮细胞。
与汉坦病毒诱导的NETosis一致，在汉坦病毒感染患者的血清中发现高水平的胞外组蛋白。已知组蛋白可引起微血管损伤，并在脓毒症中介导死亡。此外，血小板减少症、凝血酶原时间延长和纤维蛋白沉积是汉坦病毒诱导疾病的标志，且在小鼠注射组蛋白后亦可观察到。事实上，源自中性粒细胞的胞外核小体可诱导微血管内血栓形成，这被视为一种固有的宿主防御机制。重要的是，在汉坦病毒感染的SCID（严重联合免疫缺陷）小鼠模型中，耗竭中性粒细胞可预防肺炎和血管通透性增高。 甲基强的松龙治疗对HCPS患者无效的观察结果，也与汉坦病毒诱导的NETosis发挥重要致病作用的观点相符，因为皮质类固醇不抑制NETs形成。
中性粒细胞也可能通过除NETosis以外的机制促进微血管血浆蛋白渗漏（图1B）。根据信号传导所涉及的β2整合素配体以及尚未可知的微环境刺激，中性粒细胞可能被激活而不发生NETosis。粘附于活化内皮并沿内皮细胞爬行后，中性粒细胞开始跨内皮迁移并释放TNF-α，后者强烈增加血管通透性。随后，TNF-α与内皮细胞上的受体结合，诱导VE-钙粘蛋白的内吞和降解。类似地，受刺激的中性粒细胞也分泌VEGF，后者是汉坦病毒感染内皮细胞中VE-钙粘蛋白降解的重要介质。与此一致的是，在HFRS和HCPS期间发现血清VEGF水平升高。综上所述，中性粒细胞代表了汉坦病毒免疫发病机制拼图中一个长期寻觅的缺失板块。
补体系统
有充分证据表明，HFRS症状的严重程度与补体激活程度相关。补体系统与激肽系统和凝血系统一道，作为血管渗漏的重要诱导因素发挥作用。在急性HFRS期间，补体由PTX3激活，PTX3是一种体液模式识别受体。令人好奇的是，PTX3储存于中性粒细胞颗粒中，并通过整合素的外-内信号释放。在抗体和PTX3激活补体过程中产生的可溶性补体成分C3a和C5a，不仅诱导内皮细胞的细胞骨架重排，还诱导IL-8分泌。因此，PTX3将更多中性粒细胞吸引至内皮屏障，加剧血管炎症.
炎性细胞因子
在汉坦病毒感染患者的血清中可检测到高水平的促炎细胞因子，尤其是TNF-α。TNF-α由活化的抗病毒免疫细胞，如中性粒细胞、NK细胞和CD8+ T细胞，以及汉坦病毒感染的DC和巨噬细胞释放。
TNF-α是一把双刃剑。一方面，它可能通过非溶细胞机制从感染细胞中清除病毒，有助于控制汉坦病毒播散。另一方面，若以汉坦病毒感染期间发现的量外源性给予，则会诱发血管渗漏和呼吸窘迫。在内皮细胞界面局部释放的TNF-α可通过直接和间接机制增加血管通透性。首先，TNF-α不仅上调ICAM-1（β2整合素的天然配体）等粘附分子，还上调IL-8。该细胞因子既招募并激活中性粒细胞，又诱导NETs形成。其次，TNF-α可通过诱导细胞骨架重排，导致人微血管内皮紧密连接重新分布，从而直接增加血管通透性。汉坦病毒可能增强TNF-α的这种直接效应，因为与未感染对照细胞相比，HTNV感染的内皮细胞在暴露于TNF-α后表现出长时间的通透性增高。TNF-α在汉坦病毒免疫发病机制中的关键作用，或可解释利巴韦林在HCPS中相对较差的活性；它阻断ANDV复制并抑制某些炎性介质的释放，但不抑制TNF-α。
芬兰患者中，一个高产生性TNF-α基因型（-308位点多态性）与更严重的HFRS相关，尽管该关联不独立于HLA-B8-DR3单倍型。在HCPS患者中，该高产生性TNF-α基因型也比血清阳性但未患HCPS的个体更为常见。比利时的一项研究显示，一个低产生性TNF-α基因型（-238位点多态性）与更严重的HFRS存在关联。这一差异或可通过以下假设得以调和：即汉坦病毒感染的内皮细胞屏障处的TNF-α释放必须受到严格控制。若TNF-α不足，病毒可能更剧烈地复制和播散，尤其因为汉坦病毒N蛋白可干扰通过TNF受体的信号传导。这很可能由于病毒颗粒对亚细胞结构的非免疫学效应而增加血管通透性。另一方面，过多的局部TNF-α虽能更好地控制病毒，但同时可能增加免疫介导的损伤。
总结性评论
适应性免疫和固有免疫的体液及细胞机制共同促进了汉坦病毒诱导的内皮屏障破坏（图2）。令人好奇的是，迄今尚未被视为汉坦病毒免疫发病机制参与者的中性粒细胞似乎具有重要作用。NETs及中性粒细胞来源的因子，如VEGF、PTX3和TNF-α，均可导致血管功能障碍。需要进一步研究以揭示针对中性粒细胞功能的策略能否预防汉坦病毒诱导的免疫发病机制。 此外，NETs及其它中性粒细胞来源的血管通透性增高介质，可能在由其他病毒科成员引起的VHF中亦发挥一定作用。
图2 | 提出的导致汉坦病毒诱导内皮屏障破坏的免疫机制。 固有和适应性免疫应答的细胞和体液成分均可能促进汉坦病毒感染血管的渗漏。针对汉坦病毒感染的内皮细胞（EC），中性粒细胞产生NETs，或可分泌炎性细胞因子，如TNF-α，后者直接或间接增加血管通透性。体液模式识别受体PTX3和抗体激活补体。活化的补体成分诱导内皮细胞骨架重排，进一步加剧EC屏障功能障碍。NK细胞可能杀伤旁观者EC，或也分泌TNF-α。树突状细胞（DC）可能将病毒从肺组织携带至多个器官的微血管内皮细胞，或在与病毒感染的内皮细胞相互作用后被感染。随着汉坦病毒感染的DC成熟，它们迁移至引流淋巴结，启动强烈的CD8+ T细胞应答。后者可能通过直接杀伤汉坦病毒感染的EC，或更可能通过释放TNF-α，促进血管渗漏。
参考文献：
Schönrich G, Krüger DH, Raftery MJ. Hantavirus-induced disruption of the endothelial barrier: neutrophils are on the payroll. Front Microbiol. 2015 Mar 25;6:222. doi: 10.3389/fmicb.2015.00222. PMID: 25859243; PMCID: PMC4373389.
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